NO促进糖酵解增强急性中耳炎的炎症应答
中华耳科学杂志,年19卷3期
NO促进糖酵解增强急性中耳炎的炎症应答和细菌清除艾容霜范芳梅马毓蓉
董益麟何纤张欣欣
朱忆婷李丁一何於娟中耳炎发病机制复杂多样，细菌感染是其发病原因之一[1]。而急性中耳炎是儿童最常见的感染性疾病之一[2]，肺炎链球菌是其最常见的致病菌之一[3]。若急性中耳炎（AOM）久治不愈或反复发作，则造成中耳组织不可逆损伤，引起患儿听力下降、后天性耳聋、语言发育障碍，严重影响患儿生活质量[4]。因此，深入了解AOM的致病机制，将更加有效地预防和治疗AOM。
近年来，越来越多的研究发现活化的免疫细胞，如巨噬细胞，树突状细胞等，在抵抗病原体入侵时发生了“代谢重编程”以供自身能量需要。本课题组前期研究证实[5]，在S.pnAOM中，中性粒细胞作为天然免疫的第一道防线，是控制肺炎链球菌感染的关键效应细胞（≥98%）。然而，在AOM时，募集到中耳腔的中性粒细胞是否发生代谢变化尚无文献报道。有研究发现，脂多糖/γ-干扰素（LPS/IFN-γ）等刺激巨噬细胞和树突细胞（DCs）激活后，糖酵解的转变伴随有iNOS介导NO的产生，它以自分泌或旁分泌的方式使电子传递链复合物亚硝基化，从而抑制线粒体电子传递链，增强糖酵解代谢[6]。并且，有文献报道分泌性中耳炎患者中耳积液中NO表达增高[7]。然而，在AOM中，NO是否可以通过参与调节糖酵解来影响中耳的炎症应答和细菌清除尚不清楚。
因此，本研究利用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2DG）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂W分别处理后，观察糖酵解代谢变化、免疫应答及对细菌清除的影响，初步探讨糖酵解和NO在急性中耳炎中的作用机制，为急性中耳炎的治疗和慢性中耳炎的预防奠定实验基础。
1材料和方法
1.1动物模型
本实验采用C57BL/6小鼠，6~8周龄，随机分为4组：磷酸盐缓冲液PBS对照组、S.pn感染组、S.pn+2DG处理组和S.pn+W处理组，每组小鼠5～6只，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠，听泡穿刺法将S.pn19F（CFU/耳）接种于小鼠耳内建立中耳炎模型。将2DG溶于菌悬液后以相同方法接种于耳内（2DG终浓度为32.8mg/ml）。小鼠购自重庆医科大学动物实验中心。小鼠的使用得到重庆医科大学动物中心的许可。
1.2中耳灌洗液上清液的葡萄糖含量测定
采用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量，葡萄糖试剂盒购于普利莱公司，按说明书操作。
1.3中耳灌洗液上清液的乳酸含量测定
乳酸检测试剂盒购于Sigma公司；按说明书操作。
1.4细胞因子测定
通过商业化的酶联免疫反应试剂盒测定MELF上清中IL-1β(RDSystems,Minneapolis,MN,USA,#MLB00C),TNF-α(RDSystems,Minneapolis,MN,USA,#MTA00B)和IL-6(RDSystems)浓度。
1.5荧光定量PCR
采用RNeasyMinikit(Qiagen,Valencia,CA)，按说明书提取中耳灌洗液细胞中总RNA。总RNA提取后进行逆转录及荧光定量PCR，逆转录试剂盒为TAKARA逆转录试剂盒。
1.6免疫荧光
收集至少3只小鼠中耳灌洗液MELF，取μl甩片，rpm离心5分钟。干燥5分钟后用4%多聚甲醛固定10分钟。5%正常驴血清37℃封闭1小时，兔抗肺炎链球菌多糖多克隆抗体4℃孵育过夜(1:0;StatenSerumInstitute,Denmark)。二抗为结合有DyLight的驴抗兔IgG(1:0;JacksonImmuno-ResearchLaboratories,WestGrove,PA)，37℃孵育1小时。PBS洗涤后DAPI(1:;Invitrogen,USA)复染。尼康ECLIPSE80i采集免疫荧光图像。
1.7统计学方法
所有实验数据采用GraphPadPrismversion5.0(GraphPadSoftware,USA)统计软件行两个独立样本的t检验，所有实验数据用x±s表示，P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1S.pnAOM中，糖酵解上调
本研究采用听泡穿刺接种成功建立了肺炎链球菌19FAOM小鼠模型。实时定量PCR技术检测中耳灌洗液细胞中糖酵解相关基因的表达，结果显示，在建模后第1天，己糖激酶3（Hk3）、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（Pfkfb3）mRNA表达水平上调（P0.），在建模后第3天，丙酮酸激酶2（Pkm2）mRNA表达水平也明显增加（P0.01），除此之外，乳酸脱氢酶A（Ldha）和乳酸转运体Mct4mRNA水平也呈现上调趋势（图1A）。进一步对MELF中葡萄糖消耗量和乳酸的生成量进行检测，结果表明在建模后第1天，S.pn感染组MELF中葡萄糖的含量明显低于PBS对照组（图1B，P0.01），而乳酸生成量明显高于PBS对照组（图1C，P0.05），表明在AOM中，葡萄糖消耗和乳酸产生均增强。上述结果表明AOM时中耳腔募集的中性粒细胞糖酵解相关基因的表达上调，糖酵解增强。
2.2S.pnAOM中，iNOS表达上调
为验证S.pn感染后，中耳腔的中性粒细胞糖酵解增强是否通过增加iNOS表达，释放NO来实现，本研究对中耳灌洗液细胞iNOSmRNA水平进行了检测。结果显示，在中耳炎模型建立后第1、3天，中耳灌洗液细胞中iNOS表达水平均明显上调（图2A，P0.），与上述结果一致的是，MELF中NO的量也明显上调（图2B，P0.05）。而iNOS抑制剂W处理后明显降低了中耳灌洗液中NO水平（图2B）。
2.3S.pnAOM中，糖酵解促进细菌清除和炎症反应
在急性中耳炎小鼠模型建立后第1、3天，MELF细菌培养计数显示，与S.pn处理组相比，S.pn+2DG处理组中耳腔细菌载量更高（图3A，P0.01）。中耳灌洗液细胞免疫荧光结果也与此一致，即S.pn单独处理组中耳细菌载量较2DG处理组减少（图3B）。上述结果表明，AOM时，糖酵解可以促进中耳腔细菌清除。而2DG抑制糖酵解后，MELF中炎症细胞数量明显减少（图3C，d1，P0.05），表明S.pn感染时，糖酵解可以增强炎症细胞渗出。此外，本研究采用ELISA方法检测了小鼠MELF中三种炎症因子的水平，结果显示，在急性中耳炎小鼠模型中，IL-1β，TNF-α和IL-6在MELF中的含量明显增加，而经糖酵解抑制剂2DG处理后，MELF中IL-1β，TNF-α水平则明显降低，但对IL-6无明显影响（图3D，P0.01）。上述结果表明糖酵解在S.pn诱导的AOM中发挥着促进炎症反应和细菌清除的作用。
2.4S.pnAOM中，NO通过调节糖酵解促进细菌清除和炎症反应
接下来，本研究使用iNOS抑制剂W进一步探索NO在S.pnAOM中的作用。有趣的是，W同2DG处理组相似，表现为中耳细菌载量增加、炎症细胞渗出减少及组织损伤减轻。对中耳灌洗液细菌计数发现，W处理组细菌载量较S.pn单独处理组明显增加（图4A；d1，P0.05；d3，P0.01）。在S.pnAOM的第1天和第3天，W处理组中耳灌洗液中炎症细胞渗出明显减少（图4B，P0.05），炎症因子TNF-a的表达水平降低（P0.05），与HE染色结果相符，提示NO发挥了促进炎症反应和细菌清除的作用（图4C、D）。
考虑到有研究报道免疫细胞中iNOS表达介导NO的产生可增强糖酵解代谢，因此我们接下来探究在S.pnAOM中，NO是否可以通过影响糖酵解，而非传统的直接杀伤功能发挥作用。如图所示，与对照组相比，W处理组中耳灌洗液中NO的表达明显受抑（图5A，P=0.）；与此同时，中耳灌洗细胞中Hk3、Mct4的表达明显下调（图5B，P0.05）。同时，我们发现W处理组葡萄糖的消耗和乳酸的产生明显降低（图5C、D；P0.05）。然而，与对照组相比，2DG处理组中耳灌洗液中NO的表达无显著性差异，提示NO可以通过参与调控糖酵解，进而促进细菌清除和炎症反应。
3讨论
机体的免疫细胞在多数情况下处于相对静息状态，但在遭受感染等刺激时，免疫细胞迅速活化，诱导大量基因表达和生物活性物质释放。细胞从相对静止状态到活化及发挥功能的过程中，需要大量能量供应[8]。近年来，研究发现机体发生感染时活化的免疫细胞（如巨噬细胞，树突状细胞，Th17细胞等）发生了从氧化磷酸化向糖酵解转变的“代谢重编程”以提供能量和中间产物[9]，例如，鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌或结核分枝杆菌等微生物可以强烈诱导小鼠巨噬细胞的糖酵解代谢[10,11]。值得注意的是，上述研究大多
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